北京大学生物医学跨学科论坛

现代结构生物学新的研究技术

尹长城 教授

北京大学基础医学院生物物理系

英杰交流中心二层第一会议室

Cryo-electron Microscopy –An Emerging Technique in Structural Biology

Pro. Yin Chang-cheng

Department of Biophysics ,School of Basic Medical Sciences, Peking University

主持人讲话:首先欢迎各位同学来参加我们今天的讲座。我先向大家介绍一下北京大学生物医学跨学科研究中心的情况，原北京大学于原北京医科大学合并后，在韩启德院士的积极倡导下，我们成立了北京大学生物医学跨学科研究中心，招收跨专业的研究人才。韩校长相信，以两校合并为契机，我们新的北京大学一定能发挥自身优势，在二十一世纪培养出新兴学科领域的拔尖人才。从上个学期开始，我们举办了这个跨学科论坛，我们邀请的都是在各自领域作出一定成绩的年轻学者来给大家作带有科普性质的报告，希望这些报告对我们这些未来的跨学科人才有所启发。下面我们就欢迎医学部生物物理系的尹长城教授开始他今天的报告。

尹长城:

很高兴来到北大本部,与新一代的莘莘学子,未来的跨学科人才进行交流.我是最近刚从英国回到祖国.我在1990年出国,先在瑞士做了一年的访问学者,然后在英国剑桥大学Medical Research Center医学研究中心分子生物学实验室获得博士学位,又在英国做了两届博士后工作.最近看到国内的形势朝着越来越好的方向发展，我觉得大有用武之地，就决定回国发展。我在英国时是主要结构生物学方面的工作，所用的手段就是今天介绍的冷冻电子显微镜。冷冻电子显微镜是一项新兴技术，近几年得到迅速的发展，在研究大分子方面发挥重要作用。所以如果大家对研究生物学,生物大分子方面有兴趣，就要用好此项技术。

首先我向大家简单的介绍一下背景。

我们看一下什么是结构生物学? 结构生物学主要是用物理的手段,用X-射线晶体学,核磁共振波谱学,电镜技术等物理学技术来研究生物大分子的功能和结构.来阐明这些大分子相互作用中的机制。大家可以看到在结构生物学中强调结构和功能的研究技术，没有这些技术，就没有结构生物学。

结构生物学的发展经过以下几个阶段:结构生物学起源于上世纪五十年代众所周知的 Waston Crick 发现了 DNA双螺旋结构，建立DNA的双螺旋模型。60年代 当时的开文迪许实验室的M.Perutz J.Kendrew 用X-射线晶体衍射技术获得了球蛋白的结构.由于X射线晶体衍射技术的应用，使我们可以在晶体水平研究大分子的结构，在分子原子基础上解释了大分子.由于他们开创性的工作，Waston ,Crick获得了1962年的诺贝尔生理学与医学奖,M.Pertt和J.Kendrew获得了同年的化学奖.从那时起，技术的发展就成为结构生物学发展最重要的决定因素。60到70 年代,在同一实验室的他们又发展了电子晶体学技术 ，当时的研究对象主要是有序的,对称性高的生物体系，如二维的晶体和对称性很高的三维晶体。 70-80年代 ，多维核磁共振波谱学的发明使得在水溶液中研究生物大分子成为可能,水溶液中的生物大分子更接近于生理状态.最近二十年，80年代到本世纪初,冷冻电子显微镜的发明,这种技术的发明使我们不仅能够研究生物大分子在晶体状态和溶液状态的结构，而且能够研究研究复杂 的大分子体系(molecular complex)超分子体系，这就是细胞器和细胞.可见结构生物学的发展过程经历了从结晶到溶液再到大分子体系,超分子体系,如核糖体(ribosome),病毒,溶酶体(lysosome),线粒体等.

为什么要研究结构生物学?首先:结构决定功能，说到底就是一个分子的三维结构决定功能 ，因此如果要了解一个分子的功能首先要知道三维结构.人类基因组计划(Human Genome Plan, HGP )完成后,为我们提供了大量的基因组序列。但是基因只给出了一个线性的序列,一个脱氧核苷酸的序列，是一个间接的信息；而要知道更进一步的信息，必须要测定蛋白质.这就像在一个电话本上,你只能够找到人的电话号码,但这个人的职业身份外观和其他具体情况是不能知道的.基因经过转录,翻译成蛋白质, 再经过翻译后的磷酸化,糖基化等修饰,蛋白质折叠,多亚基,多复合体还要进行组装,最后才能形成有功能的单位.(gene --transcription- translation —processing —folding —assembling —function unit)所以这些信息这样一系列的过程是不可能只从单一的基因序列中得到，必须研究这些过程中分子的结构和这些大分子的相互作用，到底是发生了什么变化，这些都要用到结构生物学。另外，结构是进行其他很多研究的基础:药物设计,基因修饰,疫苗研制,人工蛋白质构建等。比如知道了一个蛋白的结构，你就可以根据它的结构特性来设计药物，作为受体，让一个小分子特异性的与它相结合，这是单个DNA序列不可能完成的。当然知道了它的结构，它的活性部位，酶活性中心就可以得知，比如得知离子通道的氨基酸组成，就可以进一步研究通道开关过程中蛋白的具体变化。 对病毒来说,如果知道它的结构,知道它在感染细胞的时候与细胞作用的氨基酸，可以根据病毒的结构来设计一些治疗的药物。另外你知道了氨基酸的组成，知道具体氨基酸在蛋白中发挥的具体作用，就可以设计出新型的蛋白质， 具有新性能，比如原来的蛋白不稳定，设计的新型蛋白就可以提高它的稳定性,且可以维持蛋白原有活性。

刚才讲到在结构生物学中重要的一个工具就是物理学手段.今天我就来介绍这些物理学手段同时比较这些方法的优缺点.首先我们来看X-射线晶体学技术，这是唯一能给出高分辨率的技术,他可以分辨到一个原子水平，这是X-射线晶体学的优点，现在测定一个大分子，最基础的根据就是X－射线晶体学；它的缺点是首先要拿到晶体,但是不是所有的生物大分子都能够获得晶体，有些大分子的复合物晶体获得比较困难,所以有些大分子达不到测定的要求；其次分子在晶体中往往是被锁定于某一状态,晶体培养的时间较长,所得到的晶体往往是分子处于基态,而分子功能的行使多发生在激发态,过渡态，X－射线晶体技术很难捕捉的分子的功能状态。

核磁共振衍射技术同样具有高分辨率的特点,仅次于X-射线晶体学技术,另外可以在溶液中操作,接近生理状态,缺点是所作样品的分子量要比较小,一般 在50KD以下,而且分子量越大所测到的谱线就越多，有时各谱线很难分辨，所以有时波谱不容易分辨.当然随着超导磁铁的发展,有可能分子量向大分子挺进，但还是有一定限制。另外核磁共振衍射技术的反应体系是溶液,这对不溶的蛋白比较困难,如膜蛋白,很难溶解，需要用去垢剂才可溶解,这就使研究复杂化。在核磁共振衍射的观察中,去垢剂会造成很大的噪音和假相.

与前两种技术不同，以上两种方法都是间接观察,都是利用衍射谱.而冷冻电子显微镜是直接观察生物大分子,是直接看到分子，因此这样的性质就决定分子越大反而越好，越利于观察,因此原则上来讲用冷冻电子显微镜观察分子，分子的大小没有上限,可用于复杂大分子,超分子体系。另外由于这种技术的特点，它可以捕捉到活化的过渡状态，可以研究分子的功能状态.另外适于薄体系,二维平面。冷冻电子显微镜最大的缺点是低分辨率,最高只达到3埃米,这是很难达到的,而X-射线晶体学技术分辨率是1埃米,核磁共振衍射技术分辨率是2埃米.

提到冷冻电子显微镜，先介绍一下电子显微镜在结构生物学中的发展。最先应用于研究大分子是起先于1950年。二十世纪五十年代,发明负染技术,这种技术由于染料的颗粒比较大，染料不浸透样品而是堆积在样品表面,所以观察到的不是分子本身而是外貌，因此它的分辨率限制在2纳米.到了六十年代,剑桥大学的科学家发展了用电镜来解释结构的理论，提出三维重构理论,用于研究病毒,由于这一项开创性研究，他获得了1982年的诺贝尔化学奖。七十年代,同一个实验室的科学家们在三维结构理论的基础上创立了生物电子晶体学理论，利用生物电子晶体学，他们就可以研究二维的高度有序的大分子 ，如二维结晶，分辨率达到0.7纳米。 到了八十年代,快速冷冻技术的发明使分辨率提高到0.3纳米,这个技术的发明导致的现在的电子显微镜的方面。可将氨基酸基团在空间定位,进行大概的结构解析.八十年代到本世纪初,利用计算机迅速发展的契机，发展图象处理技术,可应用于研究不是非常有序非结晶的生物体，大大提高了我们的研究进程。

说了半天，到底什么是冷冻电子显微镜?冷冻电子显微镜本质上还是电子显微镜，特殊的地方在于冷冻,就是在处理样品时,对样品进行快速冷冻.我们知道用水缓慢冷冻,会产生结晶,而快速冷冻,水就来不及结晶，会产生一种无序化的玻璃化状态,生物大分子被固定在这种无序的玻璃化状态，即保持在某种天然状态.由于是生物样品处于冷冻状态,所以必须用低温观察以保持,一般用低于液氮的温度(-160摄氏度).然后记录观察晶体的图象，记录的图象实际是分子二维的投影,不是分子三维结构，通过计算机图象处理,得到分子三维结构,继而根据结构进行分析功能,比如对于一个抗体，可知抗体与抗原的结合的部位,观察结合后发生的变化.

冷冻电子显微镜是如何捕捉状态的?实际操作就是要用样品钳,在铜网上加样品,将多余的；液体吸去，由于表面张力形成一层薄膜，同时将样品放到低温的液体中比液氮还低的乙烷，温度是-150摄氏度,然后液化，固化，样品固定进行低温观察。

为什么使用冷冻电子显微镜? 冷冻电子显微镜的显著优点在于将样品保持在水相,保持天然状态,第二点就是可以得到高分辨率结构;另外由于这种技术的引进，可将分子在不同状态下冻结,可以捕捉到过渡态，基态过渡态均可观察; 另外这种技术可用于观察超分子体系.

刚才说了在电镜中所观察到的不是分子的三维结构，而是分子三维结构在二维平面上的投影，作怎样从投影反推回来算出它的三维结构呢？这就是三维重构理论。三维重构理论运用的数学原理：将一个密度函数进行三维傅立叶变换，密度函数就变为频率函数。这样一个三维信息就压缩到一个二维平面上,这就是电镜照片的情况。取一个中心截面,那么一个投影的富氏变换就相当于一个三维富氏变换的中心截面。根据这样的原理，就可以根据投影得到的信息通过三维变换来算出分子在的结构。比如,分子在溶液中不同的取向,分子直立或躺倒的状态，在电镜观察时，投影是不一样的，然后将投影进行傅立叶变换，理论上说,如果得到足够多的投影,就是得到分子在所有方向上的投影,然后进行富氏变换,就可得到三维结构.这就是三维重构的具体原理。根据样品台的特点，在实际操作中有不同的方法。对于二维结构,怎么得到不同的截面呢？可以从水平开始,倾斜不同角度,以得到投影。这样的技术存在一个问题：由于样品台倾斜角度的限制,只能在0-70度之间转动,不可能从0度倾斜到90度，所以70-90度之间没有信息,这就是一个视锥问题,分辨率只有3-5埃米.第二种情况就是对于在溶液中的分子,分子取向是随机分布的,所以只要分子数量足够多,所观察的现象就可得到在不同方向上的投影,也不必旋转载物台,不必倾斜角度.以上二维结构和溶液中分子的观察,都是叠加后取平均分布结果.还有一种情况就是对于大的物体,如细胞器,细胞,由于存在个体差异,不可能用平均分布,这时就要摄取一个细胞进行照相,进行不同角度倾斜,同样由于视锥问题,70-90度之间没有数据.

最后来介绍一下冷冻电子显微镜的具体应用:首先冷冻电子显微镜应用于难以用X-射线晶体学技术和核磁共振衍射技术研究的大分子.比如一些纤维状的堆积体,我们知道朊蛋白(prion)是导致疯牛病(mad cow disease)的分子,这种蛋白的晶体很难几乎不可能培养,也很难获得均匀的溶液.这样的分子恰好可以用冷冻电子显微镜技术来研究。再如,对早老性痴呆症(alzheimer’s disease)患者体内淀粉样蛋白(beta-amyloid)沉积的结构研究，它就是一种纤维状堆积体,在去年分子生物学杂志(journal of molecular biology)发表的一篇文章:先用图象记录,获取纤维,看到4.8埃米的规则间隔,可见冷冻电子显微镜可以很好的保存样品的精细结构.然后用富氏变换,通过光学衍射得到图谱,发现beta-amyloid在4.76埃米处有一个强点,在9.6埃米处也有一个强点,而4.76埃米恰好是一个beta片层的厚度,这表明该蛋白以beta片层为一个重复周期,而9.6埃米是两个beta片层反平行排列的厚度,随后经过重构图象根据间隔来判断该蛋白是由beta片层组成反平行排列的纤维状蛋白.不仅是一些不溶的纤维可以用于冷冻电子显微镜的研究，某些可溶性的蛋白,在某些条件下也会变成不溶状态,如胰岛素(insulin)通常情况下是可溶,但也可形成纤维状聚集物.用酸处理,胰岛素会变成螺旋状纤维聚积物,经冷冻电子显微镜等观察发现该结构是由beta片层组成一根纤维,然后相互缠绕而成螺旋状.为什么经酸处理,胰岛素从可溶状态变成不可溶?这是因为胰岛素的双链在酸性条件下，即ph值小于七的情况下,构象发生变化,从有序变为无序状态,经过重折叠,两条链变为beta片层的反平行结构.

第二个应用就是 冷冻电子显微镜可用于观察分子,物质的不同功能状态，研究不同的功能蛋白.如离子通道的开放和关闭,开关的瞬间停留的非常短,如乙酰胆碱的受体,阿尔法螺旋发生顺时旋转开关从关闭到开放，加入乙酰胆碱以后结构发生改变.如肌肉收缩,加入ADP,肌肉束水平发生向上的三十度的旋转,这样一个转变使肌肉发生运动，这就是肌肉收缩的分子机制.大家学过生物化学都知道，蛋白合成循环,生化学家只是对生物化学机制进行研究,那么结构生物学家就希望能看到这种循环,实际上是怎样发生的。将核糖体(ribosome),信使RNA(Mrna),转运RNA(tRNA)和多肽，然后进行研究，发现实际的情况与生物化学学家得到的结论是吻合的，这就从结构上证明生物化学家得到的结论是正确的。而且可以具体观察到，在蛋白质合成的过程中，每一步的具体过程，如核糖体是如何与信使RNA作用的。

第三方面的应用就是冷冻电子显微镜可以为大分子测定提供初始模型。比如最近对核糖体的结构解析,开始先用冷冻电子显微镜观察,只达到20埃米的程度；后来用X-射线晶体学技术,这只能是衍射,只得到振幅,而没有相位信息,只能引进重金属获得,但核糖体这种大分子太大,引进几个重金属作用不大.后来将冷冻电子显微镜与X-射线晶体学技术结合起来,利用冷冻电子显微镜得到的结构为基础，将它引入到X－射线衍射技术中，利用相位与振幅信息相结合，可以得到7.8埃米的分辨率；2001年,分辨率已提高至5.5埃米,可就可以研究各组分的分布和相互作用.

最后就是对复杂体系的研究:如噬菌体(phage)侵染细胞时的打孔装置,十分复杂,几乎不可能获得晶体而且太大不能用核磁共振来研究,所以将各组分提取,分别用X-射线晶体学技术等获得单个组分的结构,采取个个击破的方法,再用冷冻电子显微镜重新组合,这一结果发表在今年的<自然>(nature)上.打孔装置接触细胞的一端是beta片层管状结构,DNA通过管子进入细胞.再如,对病毒与受体相互作用的研究,结晶是不可能的, 冷冻电子显微镜对复合物观察,发现受体有三个结构域,细胞用一号结构域域病毒作用,这对药物设计有指导作用.

以上就是介绍冷冻电子显微镜的应用与现状，最后介绍一下未来的发展方向:我们知道人类基因组计划完成,大家就想向研究蛋白质结构的结构基因组学方面进军,在这样一个过程中冷冻电子显微镜起什么样的作用呢？冷冻电子显微镜与X-射线晶体学技术,核磁共振衍射技术结合,就可以解析复杂体系结构.因为X-射线晶体学技术,核磁共振衍射技术只能对单个组分进行解析,要想得到复杂分子超分子体系的结构，冷冻电子显微镜可以绘出密度图，进行整合。这是未来结构生物学的方向。另外一个发展方向是与生物信息学的结合，可将特异性折叠建立数据库,然后一个复杂体系的结构就可利用数据库对冷冻电子显微镜观察得到的形态进行分析，可将结构域的信息放到大分子体系中。最后，看到分子在细胞中的实际工作,这是生物学家的一个梦想,用 X-射线晶体学技术,核磁共振衍射技术能看到分子，但只能在体外观察,体内的状态无法观察。而冷冻电子显微镜直接观察,使这一梦想有可能实现,以分子特定结构为标记(signature)进行动态时空观察研究作用功能.

提问:

问题:尹老师您好，质谱质谱连用技术也是目前在蛋白质结构分析方面的常用技术，您觉得它与冷冻电子显微镜技术的比较如何？

答：质谱质谱连用技术是将分子打成小片段,结构已知然后组合.适用于分子,单个亚基；然而对于复杂体系不适用.

问题:您能简单介绍一下冷冻电子显微镜在国际上的应用情况吗？

答：因为时间仓促,在刚才没有来得及介绍 .在国际上冷冻电子显微镜的应用已经非常广泛。在欧洲,剑桥大学的MRC分子生物学实验室，英国牛津大学，帝国理工大学，欧洲分子生物学研究所多有冷冻电子显微镜的设备。在美国有国立卫生研究院，BERKLEY国家实验室，BAYLAR医学院，PURDUE大学也有。那么大家一定要问，为什么象哈佛，耶鲁，普林斯顿这样的一流大学没有建立冷冻电子显微镜的实验室，那时因为当时他们没有预见到这项技术的重要性和发展之快。国内北京大学，清华大学，中国科学院生物物理所，国家电镜实验室都准备和正在建立这样的实验室，我回国的目的就是要在国内建立冷冻电子显微镜的实验室。清华大学和中国科学院的生物物理所都已经先后购买了冷冻电子显微镜，但目前在国内还没有一家单位能独立开展自己的工作，有的只是我们北京大学生命科学学院与国外进行合作研究。

问题：冷冻电子显微镜与以前我们所说的冷冻蚀刻技术有什么区别和联系？

答：冷冻蚀刻技术是将样品进行固定，然后用刀切割，研究膜蛋白。所得到的是所研究物体的表面形态，由于它的颗粒比较粗，所以只能观察物体的表面形态，而不能到原则水平。而冷冻电子显微镜技术由于固定方法特殊，固定于玻璃状态，不引入人工效应，且切片的厚度有问题。这种方法不要用染色，可以看到分子原子的状态。

问题：我想问一个关于构象的问题。如果是球形蛋白，有一个凹洞，如果投影，会不会有影响对其形态观察的可信度？

答：这位同学可能没有完全理会我的报告，将三维信息压缩至二维，不只是一个切面，不是信息的丢失。而且我们这在努力提高冷冻电子显微镜的分辨率：分辨率如果达到3埃米，就可以对基团进行空间定位，分辨率如果达到2埃米，可以看到碳原子，氧原子，可对重原子进行空间定位，如果达到1埃米甚至可以看到氢原子，可以对轻原子进行空间定位

问题：要进行动态观察时如何做呢？

答：冷冻电子显微镜技术不可能用于连续观察，只能是捕捉点的状态，连续的动态观察最有效的还是核磁共振衍射技术，因为是在溶液中观察。

问题：您刚才提到了视锥问题，为解决70-90度不能观察的视锥问题，可否让镜子转？

答：让电子源来旋转。理论上可能，但在实际中是不行的，电子源激发路径很长，不易控制， 但样品容易控制，用计算机就可以很好的监控。

问题：对分子的适时监控目前的办法是什么？

答：要研究分子在细胞中的功能，X-射线晶体学技术要获得结晶，核磁共振衍射技术要有水溶液体系，这两项技术都不可能。目前只能观察，用冷冻电子显微镜这一个办法，也可用光镜，但应为可见光的波长有限，需要标记，只能看路径，冷冻电子显微镜可用来看结构变化。目前电镜要求高真空，必须固定，所以不可能看连续的动态，只能选不同的时间点固定，比如说几毫秒固定一次，在来模拟推测它的连续变换。

问题：冷冻电子显微镜与扫描电镜的区别在何处？

答：冷冻电镜是透射电镜，看物体内的具体结构；而扫描电镜是利用探针扫描，对大分子不能扫到分子内部，而是表面形貌，不可能是分子内部的结构。如果是研究原子水平，没有问题。但一旦涉及到大分子，就要出现问题了。